山西股票配资网站后颅窝室管膜下瘤可演变为室管膜瘤，TERT启动子突变和6号染色体缺失是其诱因，且与复发风险增加相关

室管膜下瘤是成人后颅窝特有的良性肿瘤，在近期建立的基于DNA甲基化的中枢神经系统肿瘤分类中，其表观遗传谱被归为“室管膜下瘤，后颅窝”（PFSE）分子亚群。与之相反，大多数后颅窝室管膜瘤表现出更具侵袭性的生物学行为，被归为PFA或PFB分子亚群。部分室管膜瘤与室管膜下瘤表现出表观遗传相似性，但这类肿瘤的具体生物学特征及其潜在关联仍不明确。因此，本研究旨在分析50例PFSE亚群后颅窝室管膜肿瘤的表观遗传特征、突变谱及临床结局。

在组织形态学上，这些肿瘤包括12例室管膜瘤、14例室管膜下瘤和24例室管膜瘤-室管膜下瘤混合型肿瘤。混合型肿瘤的室管膜瘤分化程度存在差异（2%-95%），但均表现出PFSE亚群特有的整体表观遗传谱。对显微切割的肿瘤成分进行选择性甲基化组分析发现，混合型肿瘤中的CpG特征与其对应的单纯肿瘤相契合。50例病例中有20例出现6号染色体缺失，21例存在TERT突变，这些基因变异在单纯室管膜瘤中富集（p<0.001），且仅存在于混合型肿瘤的室管膜瘤分化区域。临床层面，单纯室管膜瘤表型、6号染色体缺失和TERT突变均与无进展生存期缩短相关（均p<0.001）。

综上，本研究结果表明，室管膜下瘤在肿瘤演化过程中可能发生基因和表观遗传变异，产生具有室管膜瘤形态的亚克隆（形成混合型肿瘤），并最终逐步取代室管膜下瘤成分，发展为单纯PFSE室管膜瘤。

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研究背景

室管膜肿瘤是起源于整个颅脊轴脑室系统壁的中枢神经系统肿瘤。其中，室管膜下瘤为生长缓慢的肿瘤，对应WHO Ⅰ级，主要发生于成人后颅窝。即使行次全切除术，患者的长期预后也较好。相反，后颅窝室管膜瘤对应WHOⅡ级或Ⅲ级，临床病程更具侵袭性，通常需要辅助治疗。DNA甲基化谱、基因表达特征和细胞基因学特征将后颅窝室管膜肿瘤分为三个不同的分子亚群，即“后颅窝A组”（PFA）、“后颅窝B组”（PFB）和“室管膜下瘤，后颅窝”（PFSE）。室管膜下瘤均被归为PFSE亚群，而大多数WHOⅡ级和Ⅲ级室管膜瘤则属于PFA和PFB分子亚群。PFA室管膜瘤多见于儿童患者，染色体变异较少；而PFB亚群室管膜瘤发生于大龄儿童或成人，存在广泛的染色体缺陷。借助大样本患者队列，近期的分子和临床研究证实，PFA和PFB室管膜瘤存在显著的异质性，而PFSE肿瘤通常被认为是具有良好预后的均一性亚群。兼具室管膜瘤和室管膜下瘤组织学特征的罕见肿瘤已有多次报道，小样本系列研究显示这类混合型肿瘤被归为PFSE亚群。此外，部分形态学为单纯的WHOⅡ级（及部分Ⅲ级）室管膜瘤与室管膜下瘤存在表观遗传相似性，有研究推测这类肿瘤也可能具有良好的预后。目前，关于这类肿瘤的生物学特征、潜在关联以及具有临床应用价值的生物标志物知之甚少。因此，本研究旨在阐明50例PFSE亚群后颅窝室管膜肿瘤的表观遗传关联、突变谱及临床结局。

研究结果

基于DNA甲基化谱的分型显示，室管膜瘤-室管膜下瘤混合型肿瘤归为PFSE亚群：

本研究对50例后颅窝室管膜肿瘤进行了DNA甲基化组分析，包括14例单纯室管膜下瘤、12例单纯室管膜瘤和24例兼具室管膜瘤与室管膜下瘤特征的混合型肿瘤。单纯室管膜瘤患者的平均年龄为67岁，高于混合型肿瘤患者（55岁）和室管膜下瘤患者（51岁），差异具有统计学意义（ANOVA，p=0.02；图1a）。混合型肿瘤的组织学构成差异显著，室管膜瘤区域占比为2%-95%（图1b）。24例混合型肿瘤中有2例的室管膜瘤成分表现为高细胞密度、活跃的核分裂象和/或微血管增生，符合间变性室管膜瘤（WHOⅢ级）的特征。对24例混合型肿瘤的室管膜瘤成分均进行了DNA甲基化谱分析，并对其中4例肿瘤的两个空间分离成分分别开展分析。通过基于DNA甲基化的分型方法（海德堡脑肿瘤分类器11b4版本），结合包含2801个甲基化谱的参考队列（2682例中枢神经系统肿瘤和119例非肿瘤样本）进行t分布随机邻域嵌入（t-SNE）分析，结果显示所有样本均被归为PFSE分子亚群（图1c），提示这类肿瘤具有相似的整体DNA甲基化特征。本研究进一步对显微切割的混合型肿瘤成分开展针对性分析。

图1

室管膜瘤和室管膜下瘤成分的甲基化组呈现特异性特征：

为了确定混合肿瘤成分在多大程度上改变了甲基组，而不是普遍存在的PFSE甲基化模式，本研究筛选出4例单独分析的混合型肿瘤中变异度最大的CpG位点，并进行无监督层次聚类（剔除靶向性染色体和单核苷酸多态性的探针）。当设定严格的筛选阈值（变异度最大的0.1% CpG位点）时，同一患者的室管膜下瘤和室管膜瘤成分聚为一类（图2a）。该结果可能反映了患者特异性的甲基化模式，这与先前关于胶质瘤的报道一致，也可能提示正常个体间的表观遗传变异、疾病不同阶段的患者特异性甲基化特征，或两者兼而有之。逐步提高变异CpG位点的筛选阈值（0.2%、1%和5%）后，聚类模式发生渐进性变化，病例22、23和36的室管膜瘤与室管膜下瘤成分聚为一类（图2a）。与t分布随机邻域嵌入（t-SNE）分析结果一致（图1c），病例33的两种成分仍与其他样本分离，提示该患者具有显著的特异性甲基化组特征。

图2

正常脑组织与原发性中枢神经系统肿瘤之间的DNA甲基化差异，可能是体细胞获得性表观遗传改变，以及正常脑组织与肿瘤起源细胞之间差异共同作用的结果。因此，本研究分别将室管膜下瘤和室管膜瘤成分的差异甲基化CpG位点与脑干（脑桥）非肿瘤组织进行对比。结果发现，室管膜下瘤成分存在18217个差异甲基化CpG位点，室管膜瘤成分存在25465个差异甲基化CpG位点（图2b），且两种肿瘤成分的差异甲基化CpG位点存在显著重叠（图2c）。据此推测，这些CpG位点的甲基化差异可能反映了正常脑组织与肿瘤起源细胞之间的差异。室管膜下瘤成分中重叠CpG位点的占比更高（16896/18217，93%），而室管膜瘤成分中存在相当比例的特异性CpG位点（8569/25465，34%），这可能反映了在肿瘤进展过程中，随着组织学向室管膜瘤表型转变，甲基化改变不断累积。在两种成分的特异性CpG位点中，不同表观基因组亚结构的甲基化改变探针占比极为相似（图2d）。

混合型PFSE肿瘤不同成分的特异性甲基化特征与其对应的单纯肿瘤相契合：

本研究进一步计算混合型肿瘤的室管膜瘤与室管膜下瘤成分间的差异甲基化CpG位点（校正后p值<0.05），并对筛选出的2616个CpG位点进行层次聚类。结果显示，混合型肿瘤的室管膜下瘤成分与本研究队列中的单纯室管膜下瘤聚为一类，而混合型肿瘤的室管膜瘤成分则与单纯室管膜瘤聚为一类（图2e）。

综上，上述分析表明，混合型PFSE肿瘤的室管膜瘤和室管膜下瘤成分均具有与其对应的单纯肿瘤相契合的甲基化特征。据此推测，室管膜瘤成分在肿瘤演化过程中产生，本研究进一步分析了参与PFSE肿瘤进展的基因变异。

拷贝数变异和DNA测序分析显示，6号染色体反复缺失和TERT启动子突变频发，且均与整体DNA甲基化模式相关：

利用DNA甲基化谱的信号强度值进行CNV分析，结果显示大部分肿瘤（26/50，52%）的拷贝数变异谱呈平衡状态。拷贝数变异主要表现为整条染色体或染色体臂的变异。最常见的拷贝数变异为6号染色体整条缺失（19/50，38%；图3a）。此外，1例室管膜瘤-室管膜下瘤混合型肿瘤出现6q缺失。6号染色体变异与组织学亚群显著相关：14例室管膜下瘤均未出现该变异，24例混合型肿瘤中有8例（33%）出现，12例室管膜瘤均出现该变异（卡方检验，p=9×10⁻⁷）。3例肿瘤（6%）出现8号染色体整条缺失，而在室管膜瘤中被证实具有预后价值的1q扩增，仅在50例病例中的1例（2%）出现。对4例混合型肿瘤的两种组织学成分分别进行拷贝数变异谱分析，结果显示6号染色体缺失仅存在于室管膜瘤成分中（图3b）。

图3

对1例室管膜下瘤、8例混合型肿瘤和3例室管膜瘤进行靶向下一代测序。根据本研究的过滤标准，共在编码区鉴定出37个非同义单核苷酸变异（SNVs）和小片段体细胞插入缺失突变（indels）。对所有变异进行人工验证，并根据美国医学遗传学与基因组学学会的五级分类体系进一步分型，结果显示37个变异中，17个（46%）为可能良性/良性变异，15个（41%）为意义未明变异，4个（11%）为可能致病性变异，仅1个为致病性变异，该变异存在于病例33（一间变性室管膜瘤与室管膜下瘤构成的混合型肿瘤）中（图3b）。该致病性RB1错义变异发生于第16外显子（NM_000321，c.1442dupT），导致移码突变（p.H483Sfs*10）。值得注意的是，该肿瘤还存在13号染色体长臂14.2区的局灶性缺失（包含RB1基因；图3b），且该变异仅存在于室管膜瘤成分中，提示RB1基因发生双等位基因失活。4个可能致病性变异包括PTPRD和TSC2的错义变异（病例34和42：PTPRD第14外显子c.T2243A:p.L748Q，NM_001171025；病例38和40：TSC2第2外显子c.G76A:p.E26K，NM_001318829），但变异等位基因频率约为50%，提示为杂合胚系突变，且未发现另一个等位基因存在拷贝数变异的证据。

对TERT启动子区域的检测发现，4个测序覆盖度充足的样本（病例31、33、40和42）存在C228T突变。基于此，本研究对剩余病例进行Sanger测序，证实50例病例中有21例（42%）存在热点突变，其中2例为C250T突变，19例为C228T突变。TERT启动子突变在室管膜瘤表型的肿瘤中富集：12例单纯室管膜瘤均存在该突变，而23例混合型肿瘤中有6例（26%）、13例室管膜下瘤中有3例（23%）存在该突变（卡方检验，p=3.4×10⁻⁵）。携带TERT启动子突变的患者平均年龄为64岁，显著高于野生型患者（52岁）（t检验，p=0.0012）。对2例混合型肿瘤（病例33和36）进行空间TERT测序，结果显示C228T突变仅存在于室管膜瘤成分中，室管膜下瘤成分为野生型（图3b）。

6号染色体缺失和TERT启动子突变与整体DNA甲基化模式相关：

本研究进一步分析基因学变异与PFSE肿瘤整体DNA甲基化特征的关联性，对所有样本进行无监督层次聚类，结果显示分为两个主要的甲基化聚类群。聚类群1包含13例室管膜下瘤和16例混合型肿瘤，聚类群2包含全部12例单纯室管膜瘤、8例混合型肿瘤和1例室管膜下瘤。值得注意的是，存在6号染色体缺失的肿瘤（20例）均位于聚类群2（卡方检验，p<0.001）；此外，聚类群2包含了绝大多数携带TERT突变的PFSE肿瘤（19/21，90%，卡方检验p<0.001）。

单纯室管膜瘤表型、6号染色体缺失和TERT启动子突变与肿瘤进展相关：

中位随访55个月后，35例患者存活，无肿瘤残留或病情稳定；11例患者出现肿瘤进展，1例患者死于肿瘤相关疾病。4例患者因不明原因或非肿瘤相关原因死亡，1例患者死于术后并发症，上述5例患者被排除于生存分析。33/49例患者（67%）实现肿瘤全切除（GTR）。单纯室管膜瘤患者的次全切除（STR）率显著更高（8/12，67%），混合型肿瘤患者为6/23（26%），单纯室管膜下瘤患者为2/12（17%）（卡方检验，p=0.01）。肿瘤未完全切除的患者无进展生存期显著缩短（对数秩检验，p=0.0067；图4a）；室管膜瘤患者的无进展生存期显著短于混合型肿瘤和室管膜下瘤患者（对数秩检验，p<0.0001；图4b）。值得注意的是，TERT启动子突变状态（对数秩检验，p<0.0001；图4c）和6号染色体缺失（对数秩检验，p=0.0002；图4）均与无进展生存期缩短显著相关（图4d）。TERT启动子突变状态能最清晰地区分肿瘤进展和病情稳定的患者，这类高危PFSE肿瘤的预后显著差于先前报道的137例PFB室管膜瘤。

图4

讨论

本研究分析了50例PFSE亚群后颅窝室管膜肿瘤的组织学和分子特征，并探讨其与患者预后的关联。研究队列包括14例室管膜下瘤、24例室管膜瘤分化程度不同的混合型肿瘤，以及12例无明显室管膜下瘤成分的单纯室管膜瘤。兼具室管膜瘤和室管膜下瘤分化特征的肿瘤早有报道，其组织发生学问题引发关注。部分学者推测，这两种成分可能是两个独立肿瘤克隆的“碰撞”现象；而其他假说则认为，二者起源于共同的前体细胞，早期分化为不同的亚克隆（联合现象），或一种成分由另一种成分化生或去分化而来（转化现象）。癌症的DNA甲基化谱是体细胞获得性DNA甲基化改变，与反映肿瘤起源细胞的特征共同作用的结果，因此可合理推测，PFSE室管膜肿瘤起源于共同的前体细胞，该前体细胞在肿瘤演化过程中发生额外的（亚克隆性）基因和表观遗传变异，进而形成不同的组织学表型。对混合型肿瘤的室管膜瘤和室管膜下瘤成分分别进行显微切割并分析其甲基化组特征，结果显示两种成分均被明确归为PFSE亚群，且与正常脑组织甲基化组相比，二者的表观遗传变异存在大量重叠，这一结果佐证了上述假说。本研究基于小部分CpG位点，鉴定出各亚型的特异性特征，推测这些特征反映了部分体细胞获得性甲基化改变。值得注意的是，基于该特征分析甲基化值时，混合型肿瘤的室管膜下瘤和室管膜瘤成分分别与单纯室管膜下瘤和单纯室管膜瘤的特征聚为一类。综上，尽管PFSE肿瘤的组织学表型不同，但其整体甲基化组特征强烈提示起源于共同的前体细胞，具有相同的组织发生学背景。

在分析表观遗传特征的同时，本研究还探讨了与特定组织学表型相关的基因学变异。与先前的研究结果一致，本研究发现6号染色体缺失仅存在于混合型肿瘤的室管膜瘤形态区域。此外，研究证实2例混合型肿瘤（病例33和36）的TERT启动子突变仅存在于室管膜瘤成分中。下一代测序显示，病例33的室管膜瘤成分存在致病性RB1突变，且该基因的另一个等位基因因13号染色体缺失而失活，而同一肿瘤的室管膜下瘤成分的13号染色体未出现任何变异（图3b）。特定突变塑造组织学形态的现象，在其他具有混合形态表型的脑肿瘤中也已明确，例如，多形性黄色星形细胞瘤中发生的非典型畸胎样/横纹肌样瘤（AT/RT），或SMARCB1/INI1表达缺失的室管膜瘤，其特征性变异仅存在于非典型畸胎样/横纹肌样瘤成分中。本研究中12例室管膜瘤均同时存在TERT启动子突变和6号染色体缺失，进一步支持上述观点。据此推测，这些基因学变异参与了具有室管膜瘤形态的肿瘤亚克隆的演化，因为本研究也发现，部分混合型肿瘤的室管膜瘤分化区域并未出现这些变异。

TERT启动子突变是弥漫性星形细胞瘤特定亚群的标志性变异，这类肿瘤更易复发为高级别肿瘤，即使是WHOⅡ级弥漫性星形细胞瘤，若存在该突变也可被归为WHOⅣ级。在其他癌症中，TERT启动子突变与患者年龄较大相关。一项近期研究分析了不同年龄段室管膜肿瘤的TERT启动子突变情况，结果显示120例样本中有9例（7%）存在该突变，均为成人发病的经典型室管膜瘤。值得注意的是，9例突变病例中有2例复发并出现肉瘤样成分，被诊断为室管膜肉瘤；对1例患者的样本进行显微切割分析，发现TERT突变仅存在于肉瘤样成分中。此外，已有研究报道，初始诊断为室管膜下瘤的患者，复发时肿瘤出现不典型组织学特征或进展为室管膜瘤。本研究中，携带TERT突变/6号染色体缺失的单纯室管膜瘤患者年龄显著大于混合型肿瘤和单纯室管膜下瘤患者，这一结果进一步佐证了本研究的肿瘤演化模型：室管膜瘤成分是肿瘤在演化过程中，因长期获得性分子变异而继发产生的（图5）。

图5

以往的研究系列表明，室管膜瘤-室管膜下瘤混合型肿瘤的恶性程度高于单纯室管膜下瘤，但近期的分析对这一结论仍存在争议。2016年版WHO中枢神经系统肿瘤分类建议，根据室管膜瘤成分对混合型肿瘤进行分级，但未明确室管膜瘤成分的具体占比阈值。本研究的预后分析显示，混合型肿瘤患者在肿瘤切除术后总体预后良好，仅2例出现复发。总体而言，TERT/6号染色体野生型肿瘤的进展风险低于TERT突变/6号染色体缺失的PFSE肿瘤。值得注意的是，6号染色体缺失与PFB肿瘤的复发风险增加无关，因此该变异可能是甲基化亚群特异性的效应，这与1号染色体短臂扩增类似，其仅在PFA肿瘤中具有预后价值。

后颅窝单纯室管膜瘤可分为三个具有临床意义的分子亚群（PFB、PFSE，少数为PFA），且无法通过组织学特征进行区分，因此对这类肿瘤进行分子分型十分必要。PFA室管膜瘤主要发生于儿童，预后较差；PFB室管膜瘤发生于大龄儿童和成人，总体预后较好。PFSE室管膜瘤几乎仅发生于成人，且先前被认为预后良好。与之相反，本研究数据显示，PFSE亚群室管膜瘤的复发率较高，且与先前报道的成人PFB室管膜瘤相比，无进展生存期更短，不过这一结果可能受本研究队列中患者诊断年龄较大的偏倚影响，仍需在更大样本的队列中验证。目前，儿童后颅窝室管膜瘤的标准治疗方案为最大程度的安全手术切除联合放疗，而成人患者术后辅助放疗的作用尚不明确，因此部分患者仅接受手术治疗。本研究结果提示，对于肿瘤未完全切除的TERT突变/6号染色体缺失PFSE室管膜瘤患者，可考虑采用更积极的治疗方案。在常规临床实践中，可通过DNA甲基化谱分析将后颅窝室管膜瘤患者分为已明确的PFSE、PFB和PFA分子亚群；此外，利用甲基化强度值得到的DNA拷贝数谱，可有效识别出存在6号染色体缺失的PFSE患者。由于TERT突变仅发生于启动子区的两个近端热点区域，因此可通过靶向检测的方法，筛查出TERT突变/6号染色体缺失的高危PFSE肿瘤。

综上，本研究结果表明，PFSE亚群的室管膜下瘤、混合型肿瘤和单纯室管膜瘤具有密切的表观遗传关联，提示三者起源于共同的细胞。研究发现，室管膜下瘤作为前体病变，在长期的肿瘤演化过程中，可因获得性基因和表观遗传变异，进展为具有室管膜瘤表型的混合型肿瘤，并最终发展为单纯室管膜瘤。在具有单纯室管膜瘤表型的PFSE肿瘤中，TERT启动子突变/6号染色体缺失与肿瘤复发风险增加相关，因此这些基因学变异可作为生物标志物，指导临床采用更积极的治疗方案。

“中枢神经系统肿瘤全基因组甲基化检测”项目，覆盖了CpG岛、启动子、编码区及增强子区域共约100万个CpG位点，筛选样本中的DNA甲基化位点，并与数据库中已知样本信息进行比较聚类分析，辅助中枢神经系统肿瘤的精准诊断及分子分型，同时包括了染色体拷贝数变异分析。“脑肿瘤460基因检测”和“室管膜瘤295基因检测”项目，覆盖了TERT启动子突变，若送检组织+对照血样本，可同时检测6q等染色体拷贝数变异。

参考文献：

Thomas C, Thierfelder F山西股票配资网站, Träger M, et al. TERT promoter mutation and chromosome 6 loss define a high-risk subtype of ependymoma evolving from posterior fossa subependymoma. Acta Neuropathol. 2021;141(6):959-970. doi:10.1007/s00401-021-02300-8

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